一体型マルチ

Dec 23, 2023

Nature Medicine (2023)この記事を引用

メトリクスの詳細

希少疾患を患う重症の乳児や小児は、臨床管理を指揮するために迅速かつ正確な診断に公平にアクセスできる必要があります。 Acute Care Genomics プログラムは 2 年間にわたって、遺伝的疾患が疑われるオーストラリア全土の病院に入院した重篤な乳児や子供を持つ 290 家族に全ゲノム配列決定を提供しました。結果が出るまでの平均時間は 2.9 日で、診断率は 47% でした。未診断のままだったすべての患者に対して追加のバイオインフォマティクス分析とトランスクリプトーム配列決定を実施しました。臨床的に認定された酵素分析からオーダーメイドの定量的プロテオミクスに至るまで、ロングリードシーケンスおよび機能アッセイが、選択されたケースに導入されました。これにより、さらに 19 件の診断が行われ、全体の診断率は 54% となりました。診断上の変異は、染色体の構造異常から、スプライシングを破壊するイントロンのレトロトランスポゾンまで多岐にわたりました。診断された患者 120 人 (77%) で救命救急管理が変更されました。これには、94 人の患者 (60%) に対する精密治療、外科手術や移植の決定、緩和策の情報提供などの大きな影響が含まれます。私たちの結果は、希少疾患のゲノム検査の可能性をタイムリーに完全に実現するために、マルチオミクスアプローチを主流の診断実践に統合する臨床的有用性の予備的な証拠を提供します。

ゲノム検査は希少疾患の診断を変革しています。希少疾患遺伝子発見の比類のない加速、ゲノム配列決定コストの劇的な削減、臨床応用を促進するための政府投資により、診断率と遺伝子診断の適時性の両方が大幅に向上しました1。ゲノム検査は、染色体マイクロアレイなどの以前の「ゴールドスタンダード」検査と比べて診断が得られる可能性が約 5 倍高く 2、リアルタイムでの臨床管理を導くために、迅速な所要時間で実施されることが増えています 3、4、5、6。遺伝的疾患が疑われる重症の乳児や小児に対する迅速ゲノム検査の診断的および臨床的有用性、および費用対効果は現在十分に確立されており、合計2,000人の患者を対象とした30を超える研究が世界中で発表されています5,7。複数の医療システムが標準治療としてこの種の検査に資金を提供しています8。

標的パネル、エクソーム、ゲノムはすべて迅速ゲノム検査プログラムで使用されてきましたが、全ゲノムシークエンシング（WGS）が医療システム全体で大規模に提供可能になるにつれて9,10、他のモダリティに取って代わると予想されています。 WGS は、構造およびコピー数バリアント (CNV)、ショートタンデムリピート (STR)、ミトコンドリアバリアントなどの複数のバリアントタイプを 1 回の検査で包括的に評価でき、サンプル前処理時間が短縮されるため、結果が得られるまでの時間がさらに短縮されます。これらの利点にもかかわらず、コストの高さ、時には未熟な分析ツール、および診断収率の大幅な増加に対する確固たる証拠の欠如によって導入が妨げられています11、12。さらに、WGS の分析パフォーマンスの向上と、迅速な診断プログラムによる以前よりも早いテストの開始により、既存の解釈上の課題がさらに悪化しています。現在および将来の患者にとって診断上の利点を最大化するために、発見研究と臨床検査を緊密に統合する必要性に対する認識が高まっているため、バイオインフォマティクス分析の改善とマルチオミクスアプローチの統合により、診断パフォーマンスがさらに最適化されるでしょう13。ただし、これらのアプローチが現在の診断業務の一部となることはほとんどなく、通常は専門の研究プログラムの領域であり、アクセスが制限されています。

本研究では、我々は、前向きに確認された重症の乳児および希少疾患を患う小児のコホートにおいて、迅速ゲノム診断プログラムを全国規模に拡大した。さらに、WGS の診断パフォーマンスと、追加の分析タイプ、トランスクリプトーム分析、機能アッセイを体系的に統合した影響を評価しました。

合計 333 人の乳児と子供が急性期治療ゲノミクスプログラムに紹介されました。パネルは 26 件を不適格と判断し、さらに 17 件は承認後に審査チームによって取り下げられました (図 1)。 290 人の参加者のうち、135 人 (47%) は核型が女性でした。年齢中央値は29日（0日から17歳の範囲）であった。そして64%は出生時に症状を示しました(図2c)。

遺伝的疾患が疑われる重症の乳児と小児は全国専門家委員会に提案され、承認された者は超迅速WGSを受けることになった。追加のバイオインフォマティクス分析とトランスクリプトーム配列決定がすべての未診断患者に対して実施されました。ロングリードシーケンスと機能アッセイが選択されたケースに導入されました。 ICU、集中治療室。

a, 求人サイト。ノーザンテリトリー、ノーザンテリトリー。 QLD州、クイーンズランド州。ワシントン州、西オーストラリア州。 ACT、オーストラリア首都特別地域。 NSW州、ニューサウスウェールズ州。 SA、南オーストラリア州。 VIC、ビクトリア州。 TAS、タスマニア。 b. ガイドラインと仮想専門家パネルを使用した患者選択を含む研究ワークフロー。検査の注文と同意をサポートする電子リソース。サンプルの発送。診断レポート。未解決事件に対する拡張分析とマルチオミックアプローチ。 c、研究参加者の年齢。 d、参加者の祖先/民族。 e、主要なグループによってコード化された、最も一般的な 20 の HPO 用語。

トリオ分析は 273 家族 (94%) で実施され、残りの 17 家族 (6%) は親がいないためデュオとして進められました。新生児集中治療室（NICU）に入院した患者はコホートの47％（290人中135人）を占め、39％（112人）が小児集中治療室（PICU）に入院し、15％（43人）がその他の重症入院患者であった。（たとえば、移植を待っている場合）。遺伝カウンセラーおよび/または臨床遺伝学者は、290 家族中 286 家族 (99%) に検査前カウンセリングを提供しました。コホートは民族的および臨床的に多様であり、694 の固有のヒト表現型オントロジー (HPO) 用語が患者あたり平均 5 つ記録されていました (図 2d、e)14、15。紹介の最も一般的な理由は、神経障害（筋緊張低下および発作）および症候群性または代謝性疾患のいずれかを示す複雑な多系統障害でした。

すべてのサンプルの受け取りから臨床報告までに測定された検査室の平均所要時間は 2.9 日 (95% CI 2.85 ～ 2.99) で、結果が出るまでの最速時間は 45 時間でした。すべてのレポートはサンプル受領後 5 暦日以内に発行されました (図 3a)。

a、以前の超迅速 ES コホート (n = 108) と比較した、超迅速 WGS コホート (n = 290) の臨床報告までの時間。 X は平均を表します。中心線は中央値を表します。ボックスの上端と下端は第 1 四分位数と第 3 四分位数です。ひげは、四分位範囲の 1.5 倍以下の最小値から最大値までを示し、残りの外れ値は個別にプロットされています。 TAT、所要時間。 b. WGS によって検出されたバリアント型。 c. 拡張分析とマルチオミクスアプローチによる診断収率の漸進的な向上。 CNV、コピー数バリアント。 SV、構造変異体。 UPD、片親ダイソミー。 d、診断範囲を表すサンバースト。時計回りに患者数ごとに並べると、内側のリングは主な臨床症状を表し、2 番目のリングは各グループの診断率を表します。複数の個人の診断に関与する遺伝子を隣の表に示し、主な臨床症状ごとに色分けしています。各疾患の完全名とマン番号のオンラインメンデル遺伝は補足表 1 ～ 3 に含まれています。

検査を受けた290人のうち、137人が最初の臨床分析中に診断された。診断の大部分 (137 件中 127 件、93%) は臨床医によって割り当てられた仮想パネルに含まれる遺伝子によるもので、10 件 (7%) はパネルに依存しない分析によるものでした。注目すべきことに、8件の診断（6%）は、優性疾患（SHH、FOXF1、SCN5A X2、FGFR3、RANBP2、BAG3、ENG）に関連する遺伝子の親から受け継いだ変異によるものであり、親は検査前に罹患していると認識されていなかった。これらのうち、5 人の親は臨床的に影響を受けているとその後認識され (FGFR3、SCN5A X2、BAG3、ENG)、家族内でのさらなるカスケード検査に重要な意味を持ちました。片方の親はモザイクであることが判明しました (SHH、20% モザイク)。一方、FOXF1 および RANBP2 変異体の親からの伝播は、それぞれ親由来効果 16 および不完全浸透 17 によって説明されると考えられています。 8 人は部分的な診断を受けましたが、別の 5 人は二重診断を受けました (補足表 1 ～ 3)。診断率は、単独の腎臓、皮膚、血液の表現型を呈する患者で最も高く、原因不明の間質性肺疾患を有する患者では最も低かった(図3d)。 19 個の遺伝子が複数の個人の診断の原因となり (図 3d)、他のすべての診断は独自のものであり、この臨床現場で遭遇する診断の広範な多様性を強調しています。

DMPK におけるトリプレットリピートの拡張は、低緊張症の乳児において STRipy ツール 18 を使用して特定されました (A0131129)。 STRipy は、200 を超えるリピートを含むと予測される拡張対立遺伝子を検出しましたが、拡張のサイズを正確に測定できませんでした。臨床的に認定された検査では、発端者に約 900 個のリピート対立遺伝子が存在することが確認され、これは先天性筋強直性ジストロフィーの診断と一致し、臨床的に影響を受けなかった母親では 48 個のリピート (事前変異範囲) でした。父方の対立遺伝子のサイズは正常でした。発端者におけるナノポアロングリードシークエンシングでは、1,048 リピートの拡張サイズが示されました。

Manta と Schism を使用した複雑な構造変異体の解析により、小頭症の男児の MECP2 の最後のイントロンに、おそらく SINV-VNTR-Alus (SVA) 逆転移因子に由来する、最大 2.6 kb の大きなイントロン挿入変異体が存在することが示されました。、発達遅延およびてんかん性脳症 (A0131084)。挿入の存在と起源はNanoporeロングリードシーケンスを使用して確認され、完全な2.5kbのSVA配列がMECP2の最後のイントロンに存在することが実証されました（図4b）。長距離PCRを用いた発端者と両親の検査でも、これが新たな出来事であることが確認された。 RNA データを手動で分析したところ、イントロン挿入により正常なスプライシングが破壊されたことが判明しました。ただし、野生型 MECP2 スプライシングの推定 66% が残存しており、これは臨床的重症度の低下と一致しています。注目すべきことに、MECP2 の全体的な発現は減少しておらず、また我々の独立したバイオインフォマティクススプライシング解析でもこの事象を検出できなかったことは、病原性多様体を同定するための複数のアプローチの価値を強調しています。

a、Integrated Genomics Viewer (IGV) 発端者の RNA (上) および DNA (下) のショートリードシーケンスデータ。MECP2 の最後のイントロンに偽エクソンが含まれる結果となる DNA 挿入の存在を示します。 b、挿入を示すナノポア配列データ。 c、発端者（A0131084）、親（A0131084-MおよびA0131084-P）、および対照サンプル（NA12878）の関連するMECP2領域のPCRゲル電気泳動。約2.6 kbの挿入と一致。この臨床的に認定されたアッセイは 1 回実行されました。 d、トランスポゾン由来の偽エクソン、残存標準スプライシング、最後から2番目のエクソンのスキッピング、およびイントロンリードスルーの存在を伴う、発端者におけるMECP2の観察されたスプライシング結果の概略図。 WT、野生型。

335 名 (患者 115 名とその親) から RNA 配列データを生成することに成功し、3 件の新たな診断が得られました。

骨格異形成の特徴を示す A0131122 では、RMRP における既知の病原性ヘテロ接合性プロモーター変異体が同定されました (NR_003051.3(RMRP):n.-5_-4insAACTACTCTGTGAAGCTGA)。これは軟骨毛形成不全の診断と一致します。これにより、発端者および父親のサンプルにおける影響を受けた対立遺伝子の発現が減少することが確認されました。 2 番目の一塩基挿入変異体は、当初は重要性が不明でしたが、母性対立遺伝子で同定されました (NR_003051.3(RMRP)、n.93_94insA)。母親の RNA データの分析により、この挿入により野生型対立遺伝子からの強い (>99%) 優先的な発現がもたらされることが示され、バリアント転写物の不安定性が示されました。父親の病原性バリアントと発端者における RMRP の 9.2 倍の下方制御とを組み合わせると、これは病原性を母親の挿入によるものとし、診断を確実にする十分な証拠であると考えられました。

新生児の緊張低下を呈する A0831013 では、転写開始部位 (TSS) (NM_000252.2(MTM1): c) を含む、遺伝子プロモーターの一部と MTM1 の 5' UTR にまたがる、新たな 403 bp のヘミ接合性の母性遺伝欠失が同定されました。 .-76_-11del)、筋管状ミオパチーの診断と一致します。 RNAデータの分析により、男性発端者におけるMTM1発現の減少が確認され、代替TSS利用の証拠はなく遺伝子発現が効果的に消失した。

A1031002 の GLB1 バリアントは、スプライス欠陥を引き起こすと予測される新しいホモ接合性エクソン 7 スプライスドナー領域バリアント (NM_000404.3(GLB1): c.733+6 T > C) であり、これにより中途終止コドンとナンセンスが生じる可能性があります。仲介された崩壊。 GLB1 の病原性バリアントは GM1 ガングリオシドーシスと関連しています。しかし、患者の表現型は予想より軽度でした。 RNA データの分析では、発端者に野生型転写が残存するエクソンスキッピングが示され、これはより軽度の臨床症状と一致しています。病原性スプライスバリアントの確認により、臨床試験への参加が決定されました。

別の 7 つのサンプルで確認されたスプライスバリアントが陽性対照として含まれ、そのうち 2 つではスプライス欠陥が確認されましたが、5 つは血液中での発現が不十分で情報が得られませんでした。これには、もやもや病と発達遅延のある小児における、NM_005188.3(CBL): c.1096-2 A > T の標準スプライスバリアントによって引き起こされるフレーム内エクソンスキッピングイベントの確認が含まれていました。既知の疾患メカニズム 19,20 と一致して、このスプライスバリアントは CBL の上方制御をもたらし、これは発現外れ値解析で検出され、上方制御された外れ値を慎重に評価する必要性が強調されました。

臨床的に関連する可能性が高いと考えられる 30 個の有意性不明変異体 (VUS) が報告されました。 1 名は、変異体の病原性を確立するために、国際的な協議を含む専門的な臨床再審査を受けました 21。 10 人において、追加の機能研究が実施されました (表 1)。これは、7 名による一連の臨床的に認定されたアッセイと 3 名による特注の研究アッセイで構成されていました。

我々は、A1131048 の NUP214 両対立遺伝子変異体を特定しました。 1 つの変異体 (NM_005085.3(NUP214): c.112 C > T; p.(Arg38Cys)) が以前に報告され、病原性として分類されました 22。 2 番目の亜種 (NM_005085.3(NUP214): c.929 T > C; p.(Ile310Thr)) は新規であり、gnomAD には存在せず、複数の in silico ツールによって損傷を与えると予測されました。患者の線維芽細胞からのタンパク質のウェスタンブロットでは、対照と比較してNUP214レベルの有意な減少（P < 0.05）が実証されました（図5a、b）。超解像度顕微鏡イメージングによる核領域のNUP214含有細孔の定量化により、対照と比較して核膜内のNUP214含有核細孔密度の有意な減少（ P < 0.0001）が示され（図5c、d）、以前の結果が確認されました。レポート22。定量的プロテオミクスにより、NUP214タンパク質レベルの減少が確認され（図5eおよび補足表4）、他の2つのヌクレオポリンの減少が明らかになりました。 POM121C および NUP88、後者はヒト核孔複合体内の NUP214 の物理的相互作用物質であり (図 5f)、NUP214 病原性バリアントを持つ患者で減少することが以前に報告されています 22。最後に、我々は 2 時間の熱ショック後の患者の線維芽細胞の生存率の低下を観察し、熱ストレスに対するアポトーシス反応に変化はなく、以前の報告 22 を検証しました。 A1131048 の NUP214 変異体の病原性を裏付けるこれらの複数の追加証拠を使用して、2 番目の変異体を病原性の可能性が高いものとして再分類しました。

a, 濃度測定では、対照と比較して線維芽細胞の NUP214 レベルが大幅に低下していることが示されています。 n = 細胞株あたり 6 つの生物学的サンプル。データは、平均 ± SD ホルム・シダックの多重比較検定による一元配置分散分析 (ANOVA) を表します。 b、A1131048および2つの対照（C1およびC2）からの線維芽細胞におけるNUP214の代表的なウェスタンブロット。ｃ、対照と比較したＡ１１３１０４８由来の線維芽細胞におけるＮＵＰ２１４含有核細孔複合体細孔密度（核当たりの細孔）の定量化は、Ａ１１３１０４８由来の線維芽細胞の有意な減少を示す。 3 つの独立した実験からの、細胞株あたり n = 3 の生物学的サンプル。C1 については n = 35、C2 については n = 31、A1131048 については n = 35 からのプールされたデータが示されています。データは、Holm-Sidak の多重比較検定による平均 ± SD 一元配置分散分析を表します。 d、A1131048およびコントロールの線維芽細胞におけるNUP214免疫染色（緑色スポット）および核（4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）;青色）の圧縮Zスタック代表画像。スケールバー、5μm。画像は 3 つの実験の代表的なものです。 e、健康な対照と比較したA1131048の線維芽細胞のタンパク質存在量を示す火山プロット(n = 5)。核孔複合体 (NPC) の成分は青色で示されています。横線は P = 0.05 を表し、縦線は ±1.5 の倍率変化を表します。データは両側スチューデント t 検定から得られました。多重比較に対する調整は行われませんでした。 f、NPC細胞質面の構造上にマッピングされたプロテオミクスによって同定されたNPCタンパク質の倍率変化を示すトポグラフィカルヒートマップ(タンパク質データバンク、7TBL)。黄色はNUP214サブユニットを示します。 NUP214 の周りに巻き付いている NUP88 などの他のサブユニットは、挿入図に示すように、コントロールと比較した倍率変化に従って色付けされています。灰色はデータがないことを示します。

ソースデータ

臨床的特徴の進展による再分析の結果、3 つの変異が診断として報告されました。 A0731004 は当初、複数の先天異常を示していましたが、その後生後 5 か月で発作を発症し、GABRB3 における新たな新規ミスセンス変異体の報告につながりました。 A0131108は、乳児期に最初は局所発作を示し、未診断のままだったが眼振を発症し、その結果、FRMD7の病原性多様体が報告された。最後に、乳児 A0131089 は新生児発作を呈し、KCNQ2 に同定された病原性の新規変異体と、GABRG2 に重要性が不明瞭な母性遺伝変異体を持っていました。 GABRG2 変異体は、家族歴、臨床症状の進展、および新たに発表されたデータに基づいて、2 年後に病原性として格上げされました。

10 個の遺伝子候補が GeneMatcher に提出されました。 5人は他の同様に罹患した複数の個人と一致し、現在、遺伝子と疾患の関係を確立するために調査が進められている。

5 人は情報が不十分な WGS を患っていましたが、その後、直交遺伝子検査によって診断されました。 3 件では、原因となる変異はモザイクであり、KCNT1、PIK3CA、IKBKG 遺伝子にそれぞれ 1 件ずつ存在しました。これらのそれぞれのケースにおいて、関連するバリアントは、不合格の品質パラメーター (バリアントを持つリードの 15% 以上のバリアント対立遺伝子の最小閾値) として分析からフィルターされました。 PIK3CA バリアントは線維芽細胞サンプルで検出されました (モザイクレベル 21%)。一方、KCNT1 バリアントはエクソームシーケンスで検出されました (モザイクレベル 16%)。モザイク IKBKG バリアントは、サンガーシーケンスを使用して検出されました (モザイクレベルは測定されていません)。入手可能なトリオ WGS データの検討により、この変異は母性遺伝であり、発端者の明らかなモザイクが体細胞復帰を反映していることが特定されました。

さらにもう1例は、プラダー・ウィリ症候群を引き起こす片親性15番染色体等性染色体（UPD）とマイクロアレイによって診断された。注目すべきことに、RNA シーケンスデータでは、父方から受け継いだ対立遺伝子からのみ発現される SNHG14 および SNRPN の発現欠如に基づいてこの診断を特定することもできました。これは、インプリントされた遺伝子の調節不全を特定するための RNA シーケンスデータの範囲を示しています。見逃された最後の診断は、先天性中枢性低換気症候群を引き起こすよく知られたバリアントであるPHOX2B遺伝子のポリアラニンリピート拡張でしたが、原因となる低複雑性遺伝子領域のリードカバレッジが不足していたため見逃しられました。

WGS を通じて診断された 156 人のうち、120 人 (77%) は、治療を担当する臨床医によって報告されたように、救命救急管理に変化がありました (補足表 1 および 2)。これらの多くは、調査、紹介、治療の合理化によるケア全体のプロセスの改善に関連していました。 94 人の患者 (60%) では、結果は精密治療の情報提供など、管理に大きな影響を及ぼしました。手術および移植の決定。そして緩和策。 3 名で酵素補充療法が開始され、6 名の乳児が KCNQ2 関連てんかん性脳症と診断され、抗てんかん薬の選択が決定されました。 10 件の診断 (6%) は移植に関する決定に情報を与え、35 件の診断 (22%) はケアを緩和に方向転換する決定の一部を形成しました。臨床管理に大きな影響を与える診断の一例として、A1131034 は思春期に原因不明の腎不全を患い、フレイジャー症候群と診断されました。これにより、さらなる画像処理が行われ、生殖腺の異形成が明らかになり、生検で両側性腺芽腫が同定されました。この人物はこれらを切除する手術を受け、成功しました。

この前向きに確認された全国コホートでは、分析パフォーマンスの向上とバリアントの解釈を改善するためのマルチオミクスアプローチの使用の組み合わせにより、一次検査として超高速WGSを使用することの診断上の利点を実証します。また、オーストラリアのすべての州および準州に臨床採用を拡大しながら、第 2 診断検査施設での超迅速なデータ共有、分析、報告を実装することで、全国的なアプローチの堅牢性を高めました。当社は、将来の実施の指針として、さまざまな患者グループの診断率に関する詳細なデータを提供します。

WGS の臨床検査時間は、エクソームシーケンス (ES) 3 を使用した以前に説明したコホートと有意な差はなく、サンプル受け取りから報告までの平均時間は、WGS で 2.9 日 (95% CI 2.85 ～ 2.99)、WGS で 3.1 日 (95% CI 2.85 ～ 2.99) でした。 ES の % CI 2.98–3.21)。エクソーム濃縮ステップの削除によりサンプル調製時間は短縮されましたが、データ量の増加と CNV コールの追加により平均バイオインフォマティクス処理時間が増加し、これが今後の改善の余地があることが強調されています。 WGS を使用して同定された変異型の範囲は、57 kb から環染色体までのサイズの CNV、深部イントロン変異体および制御変異体、ミトコンドリア DNA 変異体、STR、トランスポゾン挿入など、はるかに広範囲でした。 6 件の診断は、小さなコーディングバリアントと CNV の組み合わせによるもので、単一のテストで複数のバリアントタイプの分析を組み合わせて診断までの時間を短縮する WGS の有用性がさらに強調されました。

また、現在、WGS の分析可能性が、認定条件下で多くのバリアントタイプを堅牢に検出、検証、分類する能力を上回っており、下流の影響を実証するためには追加の検査手段が重要であることも明らかです。これは、MECP2 のスプライス欠陥を引き起こすレトロトランスポゾン挿入によって引き起こされるレット症候群の非定型的特徴を持つ男性発端者によって最も顕著に例証されました。この診断は、広範な最先端のバイオインフォマティクス分析、トリオ RNA シーケンス、および確立された分子技術による直交検証を組み合わせて行われました。

トランスクリプトーム解析は、さらに 3 つの診断を確定するのにも役立ちました。これらのケースでは、異常なスプライシングと発現の低下の両方が特定され、非標準スプライス部位、プロモーター欠失、非コード遺伝子の発現変化などの多様なタイプが混在していました。少なくとも 1 つのケースでは、親 RNA データの入手が解決に不可欠でした。私たちは、家族や臨床医の負担を軽減するために、WGS に提出された元の全血サンプルを使用して RNA シーケンスを実行することを選択しました。このコホートにおける RNA 配列決定から得られる追加の診断率 (2.5%) は、他の研究で報告されている (7 ～ 36%) よりも低く (参考文献 23、24、25、26)、これはおそらく、すべての研究が含まれていることを反映していると考えられます。選ばれた未解決の患者と組織特異的発現の限界よりも。これらの課題にもかかわらず、血液サンプルからの RNA に対するトリオトランスクリプトーム解析を使用する当社のアプローチは、実現可能かつ有用であることが証明されており、超高速 WGS と並行して実装をさらに検討していきます。

診断率における最大の利益は、WGS 分析によって特定された VUS の臨床的および機能的相関関係を追求したことによるものでした。これには、ウェスタンブロット、超解像度免疫蛍光イメージング、定量的プロテオミクスなどのカスタム設計の研究に至るまで、臨床的に利用できる放射線学的検査、代謝検査、免疫学的検査が含まれます。現在臨床的に利用可能なアッセイの範囲は、特定の代謝障害や免疫学的障害に焦点を当てているため、タイムリーかつ体系的な機能検証を達成することは依然として困難です。診断経路の開始時にゲノムワイドな検査がますます組み込まれるようになっているため、VUS を解決するためのハイスループットで遺伝子に依存しない機能アッセイの必要性が高まっています。このような機能アッセイは、確立された基準を使用して結果を診断レポートに組み込めるように設計する必要があります27。これらのアッセイの多くは、規模を拡大し、適切な試験資金、妥当性、再現性、結果の適時性を確保するために、研究から臨床検査室に移行する必要があります。

臨床に焦点を当てた遺伝子に依存しない分析アプローチの相対的な利点については、議論が続いています。私たちはこの 2 つを組み合わせて使用し、診断の 7% が臨床医が指名した仮想遺伝子パネル以外で達成されました。対照的に、「メンデリオム」仮想遺伝子パネル外の分析では追加の診断は明らかになりませんでしたが、10 個の遺伝子候補が得られ、GeneMatcher28 に提出されました。私たちは、以前に発表された ES コホート (n = 108、2018 年から 2019 年) に適用された同じアプローチにより、これらのいくつかが疾患遺伝子として確認されると予想しています。これまでに 6 つの遺伝子発見が得られています 29,30,31,32,33。遺伝子候補の同定は伝統的に専用の研究プログラムの領域であり、選ばれた患者が診断経路の最後にこれらのプログラムに参加することになる。クリニカルパスを通じてゲノム検査が行われることが増えているため、遺伝子候補の特定は診断分析の不可欠な部分を形成する必要があります。現在、いくつかの診断研究所が遺伝子発見に組織的に貢献した経験を報告しており 37,38,39 、これには追加のリソースが必要ですが、より広範な実施により遺伝子発見までの時間が短縮され、取り組みが拡大します。

私たちは、WGS によって見逃された 5 つの診断を認識しています。これは、いくつかの重要な制限と、特定の疾患の臨床的疑いが高い場合に代替の検査方法を検討する必要性を強調しています。そのうち 3 件はモザイクによるものであり、品質チェックに合格しなかった既知の病原性変異をレビューするように業務を修正しましたが、エクソームやターゲットシーケンスと比較して WGS の適用範囲が比較的低いため、モザイクの検出は今後も困難であり続けます。この制限は、WGS データ生成のコストが削減され、より深いシーケンスが可能になった場合にのみ克服される可能性があります。低複雑性領域における変異体の配列決定をより詳細に行うことにより、PHOX2B で見逃されたポリアラニンリピート変異体を検出する可能性も向上したと考えられます。 UPD の見逃し、およびこのコホートにおける未認定のバイオインフォマティクス分析を使用した STR バリアントと複雑な構造バリアントの特定は、診断現場で使用される分析ツールの範囲を継続的に改善および拡大する必要性を浮き彫りにしています。これらの課題の一部は、ロングリードシーケンス技術の使用を増やすことで克服できる可能性があります。我々はNanoporeを事後検証ツールとして使用しましたが、第一選択の診断検査としてロングリードシーケンシングを使用すれば、リピート拡張とトランスポゾン挿入の両方のケースで診断までの時間が大幅に短縮され、他の複雑なバリアントも同定できた可能性があります。急性環境におけるロングリードシーケンシングの使用の実現可能性が最近証明され、所要時間が劇的に短縮され、シーケンシングと解釈が分散化される可能性が期待されています6,40,41。より広範な実装の観点から見ると、臨床遺伝学者による患者の選択や集中シーケンスを含む、私たちの研究のサービス提供モデルは、医療システムの一部にしか適用できない可能性があります。急性期における迅速ゲノム検査の有用性については、現在かなりの研究が蓄積されているが、長期的な転帰データが欠如しており、これがこの研究や他の研究の大きな限界となっている。

超高速 WGS を実施している前向きに確認されたこの全国コホートでは、モデルの拡張性を実証し、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームデータを迅速に統合することによる診断収率の向上を強調します。希少疾患の患者や家族の転帰をタイムリーに変えるゲノム配列決定の可能性を十分に認識するには、診断経路の一部としてこれらのアプローチを系統的に統合する必要がある。

オーストラリアン・ゲノミクス急性期治療研究は、人間研究倫理委員会の承認を得ています (HREC/16/MH/251)。両親は、遺伝カウンセリングの後、研究への参加についてインフォームドコンセントを提供しました。

Acute Care Genomics プログラムは、遺伝的疾患が疑われる重症の小児患者に超迅速ゲノム検査を提供する全国的な複数施設の研究です。この研究では、実装科学の原則と理論に基づいて、高度に調整された臨床および実験室のアプローチが採用されています3,42。参加者は、2020年1月から2022年4月までに、オーストラリアのすべての小児病院を含む17の病院のネットワークから前向きに募集された。患者は、臨床遺伝学者による評価で単一遺伝子性疾患が疑われる状態で、参加しているNICUまたはPICUに入院した場合に対象となった。迅速な結果により管理が変更される可能性がある場合は、他の入院患者も検討されました。単一遺伝子性の病因が考えられない場合、患者は不適格であった。確実な臨床診断（アペール症候群など）が存在する場合。以前にエクソームまたはゲノム検査が実施されていた場合。または死亡または退院が差し迫っている場合（図1）。

電子紹介状は、承認のために研究調査員のパネルによってピアレビューされました。電子テストの注文と同意は、HPO 用語 15 を含む標準化された形式で臨床データやその他のメタデータを収集するため、また、新型コロナウイルス感染症による制限下でのリモート採用を管理するために使用されました。患者の性別は核型によって決定されました。両親は祖先を自己報告し、これはヒト祖先オントロジーのカテゴリーに基づいて臨床医を紹介することによって記録されました14。表現型に基づく分析をガイドするための仮想遺伝子パネルは、依頼を受けた臨床医によって割り当てられました。研究で使用されたすべてのパネルは、PanelApp Australia43 (https://panelapp.agha.umccr.org) から公開されています。データは、研究研究のためのデータ収集をサポートするように設計された安全な Web ベースのアプリケーションである REDCap を使用して管理されました44。染色体疾患の可能性が高いと考えられる場合（たとえば、プラダー・ウィリ症候群を除外するために複数の先天異常または孤立性低血圧を有する患者）、登録前に染色体マイクロアレイ（SNP-CMA）が実施されました。検査報告書は紹介する臨床医に発行され、家族向けの平易な言葉での報告書が添えられていました45。検査の理由に関係のない追加の所見は意図的に求められたものではありません。別のサブ研究では、結果から 3 ～ 6 か月後にこれらを家族に提供するための 2 段階のモデルを検討します。

WGS データの生成と臨床分析は、オーストラリア、メルボルンの Victorian Clinical Genetics Services (VCGS) またはオーストラリア、南オーストラリア州の SA Pathology によって認定された診断方法を使用して実行されました。 VCGS によって処理されたサンプルの場合、QIAamp DNA 血液ミニキット (QIAGEN) を使用して、EDTA バキュテナーに収集された血液から DNA を手動で抽出しました。 DNA の量と質は、それぞれ Qubit dsDNA BR (ブロードレンジ) アッセイキット (Thermo Fisher) と TapeStation ゲノム DNA キット (Agilent) を使用して評価されました。 Nextera DNA Flex Library Prep kit/Illumina DNA prep kit (Illumina) を使用して全ゲノム DNA ライブラリーを作成し、続いて NovaSeq 6000 装置 (Illumina) で S2 または S4 フローセルを可変的に使用して 2 × 150 bp ペアエンド DNA シークエンシングを実行しました。。目標とする平均配列深度は 30 倍で、核 DNA (nDNA) については少なくとも 10 倍、ミトコンドリア DNA (mtDNA) については最小 800 倍の平均範囲で塩基の最小 90% が配列されました。

データは、市販および社内の分析パイプラインを使用してバイオインフォマティクス的に処理されました。参照ゲノム (GRCh38) とのアライメントと核/生殖系列 DNA 変異体の呼び出しは、Dragen v.3.3.7 (Illumina) ワークフローを使用して実行されました。改訂された Cambridge Reference Sequence (rCRS) ミトコンドリアゲノム (NC_012920.1) とのアライメントとミトコンドリア DNA バリアントのコールは、Broad Institute のベストプラクティスワークフロー (https://gatk.broadinstitute.org) に基づく社内分析パイプラインを使用して実行されました。 /hc/en-us/articles/4403870837275-Mitochondrial-short-variant-discovery-SNVs-Indels)。

Somalier46 と社内ツールを組み合わせて、自動化された性別判定、関連性、および汚染チェックが実行されました。

nDNA については、Alissa Interpret ソフトウェアスイート (Agilent) のトリオ (利用可能な場合) 解析アプローチを使用して、選択したターゲット領域 (RefSeq 遺伝子 ± 1 kb) 内のバリアント解析と解釈を実行しました。 CNV は、4 つの CNV 検出ツール (Delly、Lumpy、CNVNator、および Canvas) を組み込んだ内部 CNV 検出ツール CXGo47 を使用してスクリーニングおよび解釈されました 48、49、50、51。 mtDNA バリアントの解釈では、カスタムの社内分析パイプラインを使用して大規模な欠失を視覚化し、手動フィルタリングの前に VCF ファイルにバリアント情報の注釈を付けました。 mtDNA バリアントは、ゲノム位置にアラインメントされた配列リードの少なくとも 97% にそれぞれ存在する場合、ホモプラズミックであるか、または明らかにホモプラズミックであるとみなされました。

病気との関連性が確立されている遺伝子 (メンデリオーム) は、日常的な分析中に考慮されます。 nDNA および CNV バリアントのキュレーションは、バリアントの優先順位付けに使用される事前にキュレーションされたまたはカスタムの遺伝子リストを使用して、表現型に基づいて行われました (PanelApp Australia https://panelapp.agha.umccr.org/)43。未診断の症例については、研究候補遺伝子を特定するためのすべての遺伝子のさらなる分析が行われました（以下を参照）。

nDNA、CNV、および mtDNA バリアントの分類は、米国医科遺伝学およびゲノミクス学会の適切なガイドラインに基づいて行われました。報告された信頼性の高い小さなバリアントは、通常、直交法では確認されませんでした。特に明記されていない限り、報告されたすべての CNV は直交的に検証されました。

2021年5月以降に紹介を受けた南オーストラリア州の患者については、VCGSでのデータ生成後、別の研究所であるSA Pathologyによって臨床データ分析が実施された。これらのケースでは、関連する fastq および/または bam および vcf ファイルが BaseSpace (Illumina) 経由で共有され、その後 SA Pathology の小規模変異体 (SNV および indel) 用の臨床的に認定されたシステムを使用して分析およびレポートが行われました。簡単に説明すると、バリアントアノテーションは、社内の VariantGrid v.3 解釈支援ソフトウェアを使用して実行されました。稀な遺伝性変異体（メンデル遺伝様式と一致する）および新規変異体が、臨床症状との重複について検討された。さらに、臨床表現型と最も強く関連する遺伝子に焦点を当て、発端者をシングルトンとして、遺伝様式とは無関係に、表現型主導の仮想遺伝子パネル分析が実行されました。母集団データベース (gnomAD) と社内データベース (VariantGrid) の頻度を使用して、レビューのバリアントに優先順位を付けるか除外しました。変異体は、コンピュータでの病原性予測、配列保存スコア、タンパク質の機能と発現、および既知の疾患との関連に基づいてさらに優先順位が付けられました。結果は、VCGS によって実行されたコピー数および mtDNA 分析と統合されました。候補バリアントは IGV でレビューされました。報告可能なすべての変異体は品質基準を満たしていたため、直交的な方法では確認されていませんでした。

すべての未診断症例からのデータは、STRipy18 を使用して STR 拡張について分析され、Manta52 と Schism (https://github.com/ssadedin/schiism) を使用して、関連する遺伝子の 50 kb 上流および下流内の逆位や構造変異などのバランスのとれた構造変異についてスクリーニングされました。。イベントは手動で評価され、臨床的に関連する遺伝子への妥当な近接性とともに遺伝が確認されました。結果は、報告前に臨床的に認定された方法を使用して直交的に検証されました。複雑な構造変異と大きなリピート拡張が、ロングリードシークエンシング (Nanopore) を使用して確認されました。

すべての未診断の症例において、de novo および劣性の影響の大きいバリアントに焦点を当て、分析をすべての遺伝子のバリアントに拡張しました。遺伝子特性および/または文献研究に基づいて、生物学的に妥当な遺伝子候補が GeneMatcher28 に提出されました。

未診断のすべてのケースでは、Omega Bio-Tek EZNA DNA/RNA Isolation kit を使用して EDTA 血液から RNA を抽出しました。抽出された RNA の定量的および定性分析は、Qubit RNA アッセイキット (Thermo Fisher)、TapeStation High Sensitivity RNA および標準 RNA キット (Agilent) を使用して実行されました。 RNA シークエンシング用のライブラリーは、Illumina TruSeq 鎖トータル RNA ゴールドキット (リボソームおよびグロビン RNA 転写阻害用のプローブを含む) を使用し、続いて NovaSeq 6000 2 × 150 bp ペアエンドシークエンシング (Illumina) を使用して、S2 または S4 フローを可変的に使用して構築しました。サンプルあたり約 8,000 万のフラグメント (約 1 億 6,000 万のペアエンドリード) を目標とした細胞。遺伝子発現の真の外れ値を特定するために、Bioconductor パッケージ OUTRIDER53 が利用されました。 17 人の発端者が一緒に分析され、親のサンプルは別々に分析されました。品質管理のため、サイズ係数が 0.1 未満のサンプルは分析から除外されました。全体として、9,651 個の遺伝子がゼロカウント (発現されていない) により除外されました。これは、Gencode v.37 の元の注釈付き遺伝子の 16.2% を占めました。下方制御された遺伝子に焦点を当てて、サンプルあたり調整された P 値 < 0.1 の遺伝子が調べられました。

ナノポア配列決定のための DNA は、上記のように EDTA 血液から抽出されました (ゲノム配列決定)。データは、v.10.4.1 フローセルと化学を使用して Promethion 上で生成され、その後、IGV で視覚化する前に Minimap2 を使用してアライメントが行われました。

プライマーは、レトロトランスポゾン挿入に隣接するイントロン領域に結合するように設計されました (MECP2-int4-gDNA-Fwd: 5'-GCCTCTCCAAAGTTCAGCAAC-3'; MECP2-int4-gDNA-Rev: 5'-TGCCCTGAGTGGGAAGTTCT-3')。 PCRは、PrimeStarGXL DNA Polymerase (Takara Bio)を製造業者の指示に従って使用して実施した。次に、発端者 (A0131084)、両方の親 (A0131084-M および A0131084-P)、および NA12878 (Coriell) からの 50 ng のゲノム DNA を、テンプレートなし対照反応と並行して増幅しました。反応は 1% E-Gel EX (Thermo Fisher) で実行され、GelDoc XR (Bio-Rad) を使用して視覚化されました。

表現型に関連し、「病原性の可能性が高い」分類に近い VUS が報告され、機能研究および/または追加の臨床相関関係 (画像研究など) にアクセスするための経路が模索されました。可能な場合には臨床的に認定された機能アッセイが使用され、一部のバリエーションについては研究グループに参照されました。ウェスタンブロットは以前に記載されているように実行されました54,55。

個人 A1131048 の線維芽細胞と 2 つの無関係な小児対照線維芽細胞 (生後 2 か月の女性と 16 歳未満の女性) の線維芽細胞の初代培養は、前述のように皮膚生検から確立されました 56。線維芽細胞は、基礎培地（10％ウシ胎児血清（Gibco）、100 U ml-1 ペニシリンおよび 100 μg ml-1 ストレプトマイシンを含む高グルコース DMEM（Gibco））中で 37 °C、5％ CO2 で培養しました。すべての線維芽細胞対照細胞株は社内で樹立され、遺伝性疾患の疑いのない小児個人から樹立されました。すべての細胞株はマイコプラズマ陰性であり、NUP214 遺伝子型は次のプライマーを使用した PCR およびサンガー配列決定によって検証されました。NUP214 chr9:131127590c.112 C > T; p.(Arg38Cys); 転送: GAGACAGACCTTGGTCTCAGTAA; Rev: AGCATGCCACCATACTCCTC および NUP214 chr9:131134995c.929 T > C; p.(Ile310Thr); 転送: CGGTTGATGGCCAATGTTTGT; Rev: CAAGGCATCTCAGCCTCCATT。

変性ゲルの場合、前述のように線維芽細胞からタンパク質を抽出し、タンパク質 30 μg を SDS-PAGE で分離し、PVDF (Merck、カタログ番号 IPVH00010) に移しました 57。一次抗体は、ヒト NUP214 (カタログ番号 ab70497) およびヒト GAPDH (カタログ番号 G9545、Sigma Aldrich、1:10,000 希釈) および適切な抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体 (GE Healthcare、1:5,000 希釈) に特異的でした。 )、増強された化学発光試薬 (Bio-Rad) および Bio-Rad ChemiDoc を使用してバンド強度を捕捉しました。抗体は、滴定された量の対照ヒト線維芽細胞溶解物に対して製造業者によって検証され、製造業者のプロトコールに従って使用された。タンパク質バンド強度は、Image Lab v.6.0 ソフトウェアを使用して定量化されました。

患者および対照線維芽細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBST(PBS + 0.5% Triton X-100)で洗浄した。細胞をブロックし、室温で 1 時間、PBST 中の 1% BSA で透過処理しました。細胞を、一次抗体抗NUP214抗体（ウサギ、カタログ番号ab70497）をPBST中の1％BSA（1：500）で希釈し、室温で1時間プローブし、PBSで洗浄した。二次インキュベーションは、Alexa Fluor 488 結合ヤギ抗ウサギ抗体 (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 A-11008) を含む PBST (1:1,000 希釈) 中の 1% BSA で室温で 1 時間行い、PBS で洗浄しました。カバースリップは、DAPI (Life Technologies) を備えた ProLongTM Gold Antifade を使用して顕微鏡スライド上にマウントされました。

A1131048 患者および 5 つの対照線維芽細胞株の線維芽細胞ペレットを 5% SDS および 50 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムに再懸濁しました。各サンプルの総タンパク質濃度を Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Thermo Fisher) で定量し、患者については 25 μg のタンパク質を 3 回に分けて、各対照細胞株については 1 回ずつサンプルを採取しました。サンプルは、メーカーの指示に従って S トラップマイクロスピンカラムを使用して処理し、40 mM クロロアセトアミド (Sigma) および 10 mM トリ(2-カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩 (BondBreaker、Thermo Fisher) を使用して還元およびアルキル化を実行しました。タンパク質消化は、トリプシンとタンパク質の比率 1:10 で 37 °C で一晩実行し、溶出したペプチドを CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator (Labconco) を使用して乾燥させました。サンプルを 45 μl の 2% アセトニトリル、0.1% トリフルオロ酢酸緩衝液で再構成し、各サンプル 2 μl を液体クロマトグラフィー (LC) - タンデム質量分析 (MS/MS) 用に注入しました。データは、Ultimate 3000 HPLC (Thermo Fisher) および NanoESI インターフェイスと組み合わせた Orbitrap Eclipse 質量分析計 (Thermo Fisher) で取得しました。このシステムには、Acclaim Pepmap ナノトラップカラム (Dionex-C18、75 μm × 2 cm) および Acclaim Pepmap RSLC 分析カラム (Dionex-C18、75 μm × 50 cm) が装備されており、データ独立収集モードで実行されました。前述の方法を使用します58。生ファイルは、150,106 個のペプチド前駆体を含む深く分別された対照線維芽細胞サンプルから生成されたデータ依存的に取得されたペプチドライブラリーに対して、Spectronaut (v.16.2.220903.53000、Rubin) を使用して処理されました。デフォルトの Spectronaut BGS Factory 検索パラメーターを、「単一ヒットタンパク質を除外する」設定を選択し、「メジャーグループ上位 N」および「マイナーグループ上位 N」オプションの選択を解除する変更を加えて使用し、同定されたすべてのペプチドを定量対象として考慮できるようにしました。タンパク質は、UniProt レビュー済みヒト標準およびアイソフォームデータベース (42,360 エントリ) を使用して検索されました。

データは処理のために Perseus (v.1.6.15.0) (参考文献 59) にインポートされ、既知の汚染物質がフィルタリングされ、すべての MS2 量レベルが log2 変換されました。 A1131048 患者と対照群を少なくとも 2 つの有効な値を持つタンパク質についてフィルタリングし、両側 t 検定を実施しました。火山プロットは、±1.5 倍変化 (log2 ± 0.585) および P 値 = 0.05 (-log10 = 1.301) に設定された有意性を持つ散布図関数を使用して生成され、NPC コンポーネントには手動で注釈が付けられました。 NPC コンポーネントの Log2 変換された変化がエクスポートされ、その値を使用して、PyMOL Molecular Graphics を使用して、低温電子顕微鏡法由来の複合構造 (Protein Data Bank アクセッションコード 7TBL) 上の関連タンパク質の倍率変化に従って、特定のサブユニットを表す鎖を色分けしました。システム、v.1.7.2.1 (シュレディンガー)60,61。

NUP214 を含む核孔密度の画像は、Airyscan 2 超解像度イメージングを備えた Zeiss LSM 900 共焦点顕微鏡で取得されました。 NUP214 免疫染色細胞は、×63 油浸レンズと一連の 30 スライスの Z スタックで捕捉されました。 NUP214 定量化の場合、Z スタック画像は、Z 投影と「最大投影」を使用して ImageJ で平坦化されました。画像をCellProfilerにロードし、核の領域をマスクして細胞質染色を排除し、核あたりの「スポット」の数を測定するパイプラインを開発しました。核形態については、Zeiss Axiovert 顕微鏡を用いて倍率 20 倍で細胞を画像化し、核形態を正常または異形形態を有する核のいずれかとしてスコア化し、ブラインド評価により前述した 62 ように、水疱、陥入、微小核小体またはヘルニア化核に分類しました。

アポトーシス、生存率、および細胞毒性は、ApoTox-Glo Triplex Assay キット (Promega、カタログ番号 G6320) を使用して、以前に記載された方法に若干の変更を加えた 22 に従って、熱ショック後に評価されました。細胞を熱ショックストレスにさらすために、まずウェルあたり 10,000 個の線維芽細胞を 96 ウェル ELISA マイクロプレート内で 37 °C で増殖させ、一晩付着させました。翌日、増殖培地を予め温めておいた培地と交換し、細胞を43℃のインキュベーターに移し、熱ストレスに2時間曝露した。次に、細胞を 37 °C に戻し、さまざまな時点で回復させました。アポトーシス誘導のポジティブコントロールを提供するために、2.5 μM スタウロスポリンを増殖培地に 6 時間添加しました。細胞毒性の陽性対照を提供するために、70 μM ジギトニンを培地に 15 分間添加しました。蛍光（生存率（400Ex/505Em）および細胞毒性（485Ex/520Em））および発光を、FLUOstar Optimaマイクロプレートリーダー（BMG Labtech）で測定した。

代替の遺伝子検査方法を使用して達成された診断に関するデータは、紹介する臨床医から収集されました。

超迅速 WGS 後の管理の変化に関するデータは、構造化データ収集手段を使用して、結果の 3 か月後に REDCap 調査を通じて紹介臨床医から収集されました (補足表 5)。これらは 3 つの主要なカテゴリに分類されます。ケアの方向を緩和に向けること。対象を絞ったサーベイランス（既知の合併症を対象とした調査とサブスペシャリストへの紹介）。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。サンプルサイズは利用可能な資金によって決定されました。分析から除外されたデータはありません。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究から得られた匿名化されたゲノムおよび関連データは、倫理的に承認された研究に利用できます。データアクセスリクエストは、オーストラリアゲノミクスデータアクセス委員会の承認を必要とするオンライン申請フォームを通じて受け付けられます。データにアクセスするには、[email protected] に電子メールを送信してください。データアクセス要求は委員会によって月に 1 回検討されます。データにアクセスするには、データ転送契約が必要です。署名が完了すると、データはオーストラリアンゲノミクスのゲノムデータリポジトリから要求者に転送されます。この研究で報告されたすべての変異体は、ClinVar (SUB13026601、SCV003921769 ～ SCV003922018) に寄託されています。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD042001 とともに PRIDE パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

使用される Web リソースは次のとおりです。

ClinVar: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar

GATK: https://gatk.broadinstitute.org

gnomAD: https://gnomad.broadinstitute.org

HPO: https://hpo.jax.org/app

人類の祖先オントロジー: https://www.ebi.ac.uk/ols/ontologies/hancestro

IGV: https://software.broadinstitute.org/software/igv

NCBI RefSeq: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

マンタ: https://github.com/Illumina/manta

OMIM: https://omim.org

PanelApp オーストラリア: https://panelapp.agha.umccr.org/

シズム: https://github.com/ssadedin/schim

ストライピー: https://stripy.org

ユニプロト: https://www.uniprot.org/

バリアントグリッド: https://variantgrid.com

VEP: https://ensembl.org/info/docs/tools/vep.ソースデータはこの文書とともに提供されます。

Schismは、テストサンプルの生のリードを大規模に集約されたコントロールセットからサンプリングされたものと比較することにより、先入観のあるモデルを押し付けることなく、ショートリード全ゲノムデータの新たな変異を特定します。研究中に使用された Schism コードは、GitHub (https://github.com/ssadedin/schiism) で入手できます。この研究中に使用された VariantGrid コード (www.variantgrid.com) は、GitHub (https://github.com/SACGF/variantgrid) でビジネスソースライセンス 1.1 に基づいて研究用途に利用できます。

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この研究に参加したすべての家族と彼らのケアに関わった臨床チームに感謝します。急性期治療ゲノミクスプログラムは、Medical Research Futures Fund、Genomics Health Futures Mission (GHFM76747; to ZS)、Royal Children's Hospital Foundation 助成金 (2020-1259; to ZS)、および Queensland Genomics (to CP) によって資金提供されました。現物支援は、Australian Genomics (National Health and Medical Research Council は GNT1113531 および GNT2000001 を KNN に助成) およびシドニー小児病院ネットワーク (MW に) によって提供されました。この研究は、オーストラリア国立健康医学研究評議会 (GNT2009732 および GNT1164479) からの助成金およびフェローシップによって支援されました。私たちは、機器、トレーニング、技術サポートの提供について、水戸財団および Bio21 質量分析およびプロテオミクス施設に感謝します。 LS は、メルボルン国際研究奨学金と水戸財団博士追加奨学金によって支援されています。マードック児童研究所で行われた研究は、ビクトリア州政府の運営インフラ支援プログラムによって支援されました。 JC に授与されたゲノム医学の委員長は、王立小児病院財団から多大な支援を受けています。図 2a で使用されているマップは、canva.com からの Pro Content ライセンスに基づいて提供されています。図 2b で使用されているアイコンは、thenounproject.com からロイヤリティフリーのライセンスに基づいて提供されました。

Victorian Clinical Genetics Services、マードック小児研究所、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

セバスチャン・ランケ、ティオン・Y・タン、ベリンダ・チョン、ディーン・フェラン、デヴィッド・フランシス、ステファニー・エガーズ、シモーネ・ローリー、ジェマ・R・ブレット、ミシェル・G・デ・シルバ、アンドレアス・ハルマン、デヴィッド・A・ストラウド、アリソン・G・コンプトン、デヴィッド・R.ソーバーン、カトリーナ・M・ベル、サイモン・サディン、ゾーニツァ・スターク

医学、歯学、健康科学、メルボルン大学、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

セバスチャン・ルンケ、ティオン・Y・タン、ジェマ・R・ブレット、ミシェル・G・デ・シルバ、ニコール・J・ヴァン・バーゲン、リアナ・N・セムセセン、デビッド・A・ストラウド、アリソン・G・コンプトン、デビッド・R・ソーバーン、サイモン・サデディン、キャスリン・N . ノース、ジョン・クリストドゥロウ & ゾルニッツァ・スターク

オーストラリアン・ゲノミクス、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

セバスチャン・ルンケ、ソフィー・E・ブフラー、マチルダ・R・ジャクソン、ハミッシュ・S・スコット、キルステン・ボッグス、アナ・ラコンジャック、キャスリン・N・ノース、ジョン・クリストドゥロウ、ゾルニツァ・スターク

Genetic Health Queensland、ロイヤルブリスベンアンドウィメンズ病院、ブリスベン、クイーンズランド州、オーストラリア

シラグ V. パテル

シドニー小児病院ネットワーク – オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、シドニー、ウェストミード

サラ・A・サンダラドゥラ、メレディス・ウィルソン、キルスティン・ボッグス、アナ・ラコンニャック

シドニー大学小児病院ウェストミード臨床学校、シドニー、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

サラ・A・サンドラ、メレディス・ウィルソン、ジョン・クリストドゥロウ

シドニー小児病院ネットワーク – オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、シドニー、ランドウィック

ジェイソン・ピナー、キルステン・ボッグス、アナ・ラコンジャック

医学と健康、ニューサウスウェールズ大学、シドニー、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

ジェイソン・ピナー

Monash Genetics、Monash Health、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

マシュー・F・ハンター & アマンダ・スプリンガー

モナッシュ大学小児科、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

マシュー・F・ハンター & アマンダ・スプリンガー

オーストラリア、南オーストラリア州ノース・アデレード、ウィメンズ・アンド・チルドレンズ病院、小児生殖遺伝学ユニット

クリストファー・P・バーネット & カースティ・スタラード

遺伝分子病理学部門、SA Pathology、アデレード、南オーストラリア州、オーストラリア

クリストファー・P・バーネット、カリン・S・カッサーン、トゥオン・ハ、ソン・ガオ、ピア・アーツ、マチルダ・R・ジャクソン、ハミッシュ・S・スコット

アデレード医科大学、アデレード大学、アデレード、南オーストラリア州、オーストラリア

クリストファー・P・バーネット、カリン・S・カッサーン、ピア・アーツ、ハミッシュ・S・スコット

タスマニア臨床遺伝学サービス、タスマニア医療サービス、ホバート、タスマニア、オーストラリア

マシュー・ウォリス

タスマニア大学医学部およびメンジーズ医学研究所（オーストラリア、タスマニア州ホバート）

マシュー・ウォリス

西オーストラリア州の遺伝サービス、パース、西オーストラリア州、オーストラリア

ベンジャミン・カミエン & ミシェル・ウォード

オーストラリア首都特別地域、キャンベラ、キャンベラ病院臨床遺伝学部門

メアリー・ルイーズ・フレックマン

Center for Cancer Biology、SA Pathology と南オーストラリア大学（南オーストラリア州アデレード）との提携

トゥオン・ハ、ピア・アーツ、ハミッシュ・S・スコット

UniSA Clinical and Health Sciences、南オーストラリア大学、アデレード、南オーストラリア州、オーストラリア

トゥオン・ハ、ピア・アーツ、ハミッシュ・S・スコット

マードック児童研究所、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

ミシェル・G・デ・シルバ、キャス・シモンズ、トーマス・コンウェイ、ニコール・J・ヴァン・バーゲン、ティム・シコラ、デヴィッド・A・ストラウド、アリソン・G・コンプトン、デヴィッド・R・ソーバーン、カトリーナ・M・ベル、サイモン・サデディン、キャスリン・N・ノース＆ジョンクリストドゥロウ

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SL、SEB、ZS が原稿を作成しました。 CVP、SAS、M. Wilson、JP、MFH、CPB、M. Wallis、BK、TYT、MLF、JC、ZS が研究募集と患者の選択と承認を調整しました。 BC、DP、DF、KSK、RH、SG、PA、MRJ、HSS、SE、SR、SL、ZS はゲノムデータを処理し、データ分析を実行しました。 KB、AR、GRB、MCdS、AS、M. Ward、KS は、患者の同意と結果の開示を含む遺伝カウンセリングのサポートを提供しました。 CS、TC、KMB、SS、SL、ZS はトランスクリプトームデータを処理および分析しました。 AH、SS、KMB は追加のバイオインフォマティクス分析を実行しました。 NJVB、TS、LNS、DAS、AGC、DRT が機能解析を実行しました。 CVP、SAS、M. Wilson、JP、MFH、CPB、M. Wallis、BK、TYT、MLF、JC、SL、KNN、SS、MGdS、GRB、SEB、ZS が研究の構想に関与しました。著者全員が原稿を読んで承認しました。

ゾルニツァ・スタークへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Medicine は、この研究の査読に貢献してくれた Kym Boycott と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Anna Maria Ranzoni、Nature Medicine チームとの協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足表 1 ～ 5。

未処理のウェスタンブロット。

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転載と許可

Lunke, S.、Bouffler, SE、Patel, CV 他全国規模での迅速な希少疾患診断のための統合マルチオミクス。ナット・メッド (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41591-023-02401-9

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受信日: 2022 年 12 月 15 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-023-02401-9

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